Publicado em 02/06/2017

História evolutiva da família de proteínas NOX em artrópodes

A NADPH oxidase (NOX) é uma enzima composta por várias subunidades que funcionam juntas a fim de gerar as chamadas espécies reativas de oxigênio (EROS) que são pequenas moléculas altamente eletrofílicas que são derivadas do oxigênio, como o superóxido, radical hidroxila e peróxido de hidrogênio. O papel fisiológico desse complexo está em fornecer uma modulação precisa no balanço dos níveis de EROS a fim de regular eventos de sinalização celular que são dependentes dessas moléculas. Além disso, elas também contribuem para a defesa antimicrobiana da célula.

Num trabalho realizado em colaboração com a Fiocruz, um grupo de 5 pesquisadores investigou a evolução do gene NOX em grupos de artrópodes. O trabalho é assinado pela Dra. Ana Caroline Paiva Gandara (IBqM), que dividiu a primeira autoria do artigo com o doutorando André Quintanilha Torres sob supervisão dos Professores Pedro L. Oliveira (IBqM) e Renata Schama (Fiocruz) .

NOX vs Evolução

Publicado em 29 de Março deste ano pela revista científica BMC Evolutionary Biology, o artigo ”Evolutionary origin and function of NOX4-art, an arthropod specific NADPH oxidase” descreveu a diversidade e a evolução da família de genes NOX em artrópodes utilizando uma combinação de ferramentas bioinformáticas e laboratoriais.

O estudo realizou uma análise acurada de 70 genomas e 55 transcriptomas completos de artrópodes, com o objetivo de delinear e descrever a história evolutiva da família NOX em artrópodes. Essa família gênica é composta por diversas isoformas e os mamíferos possuem sete formas diferentes. Curiosamente, essa análise revelou que um dos genes da família NOX que tinha sido encontrado apenas em Anopheles gambiae e Aedes aegypti até então pode ser encontrado em toda a linhagem dos artrópodes! Além disso, por apresentar distribuição desproporcional entre as espécies, já que nem todas possuem esse gene, ele foi apontado como um exemplo de evolução por perda gênica. Um dos questionamentos abordados no estudo foi se a perda desse gene em algumas linhagens estaria ligada à presença da enzima conhecida como DUOX.

nox

A Dra. Ana Gandara esclareceu essa e outras questões sobre seu artigo para o nosso Portal!

PORTAL BIOQMED. Bom dia, Dra. Ana! Gostaríamos de saber como surgiu a ideia de estudar a família de genes NOX nesse trabalho.

DRA. ANA GANDARA. Bom dia, Larissa. A história é a seguinte: eu trabalhava com a enzima NADPH oxidase de barbeiros durante meu doutorado. As NADPH oxidases formam uma família de proteínas codificadas por genes diferentes. As enzimas dos mamíferos são as mais estudadas e neles encontramos sete genes NOX diferentes. Todas elas produzem peróxido de hidrogênio ou superóxido. A questão é que só existiam duas isoformas dessas proteínas descritas em insetos até então: a NOX 5 e a DUOX. Em um trabalho publicado em 2007, foi mostrado que existe uma terceira isoforma, que foi chamada de NOXm. Nessa época só eram conhecidos os genomas de cinco insetos e dentre eles, dois não tinham o gene e três tinham a NOXm, além da NOX 5 e da DUOX. Coincidentemente, Anopheles ambiae, Culex quinquefasciatus e o Aedes aegypti tinham a NOXm e a Drosophila melanogaster e abelha (Apis mellifera) não possuíam. Nesse estudo, eles concluíram que essa era uma isoforma específica de mosquito. Portanto, vimos que, em insetos, além de NOX 5 e DUOX, os dípteros hematófagos (lembrando que Drosophila também é um díptero) - que são uma ordem de insetos específica que possuem um dois pares de asas, sendo o sendo o segundo par não funcional para voar e sim para equilíbrio - tinham uma NOX específica dessa ordem. Então, em 2011, um pesquisador publicou um trabalho usando o gene NOXm como se dissesse: ”olhem, o Aedes tem esse gene também aqui”.

Em 2012, eu comecei a me perguntar ”Será que o Rhodnius prolixus tem esse gene, já que ele é hematófago?”. O trabalho de 2007 havia feito uma pequena discussão sobre isso, concluindo resumidamente que isso poderia estar relacionado a hematofagia característica desse grupo de insetos. Na época, estávamos fazendo o genoma e o transcriptoma do Rhodnius prolixus e eu tinha os dados brutos em mãos. Assim, fui buscar no genoma e transcriptoma e, no entanto, não encontrei a NOXm, mas somente a NOX 5 e DUOX. Com isso, fiquei com essa pergunta na cabeça: ”e agora, quem tem a NOXm?”.

Meu ECG (Exame de Conhecimentos Gerais) havia sido em filogenia molecular e eu queria trabalhar com isso por que já tinha lido sobre o assunto e estava muito interessada! Na mesma época, o projeto 5k, que tinha o objetivo de sequenciar 5.000 genomas de insetos, estava sendo desenvolvido. Com isso, estavam saindo muitos genomas de insetos e havia a disponibilidade de muitos dados genômicos para trabalharmos que poderiam resolver de forma definitiva essa questão. Fizemos então um update desse trabalho. Eu cheguei levantar a hipótese de que esse poderia ser um pseudo-gene que estaria se perdendo. Eu queria saber (i) se a NOXm era um gene real ou (ii) se era um pseudo-gene. Se fosse um gene real, nós trabalharíamos com o gene de Aedes aegypti e este seria mais um gene muito interessante para estudarmos. Até por essa questão, o Prof. Pedro me incentivou a prosseguir com essa proposta: quem tem NOXm na ordem de insetos? Mas levei a pergunta um pouco mais adiante e busquei quem possuía a NOXm entre os artrópodes. Lembrando que os insetos formam uma classe dentro do filo dos artrópodes.

A partir de então, o trabalho foi fundamentado em buscar responder se o gene estava ali porque era usado ou porque era um resquício evolutivo que ainda não teria sido descartado pela seleção natural. Esse possível pseudogene poderia não produzir uma proteína funcional, mas poderia ter ainda alguma função em nível de RNA.

Então buscamos esse gene em todos os genomas publicados de artrópodes…

PORTAL BIOQMED. E as NOX envolvidas na produção das espécies reativas de oxigênio são bem caracterizadas nos artrópodes? Quais novas informações vocês conseguiram desvendar sobre a função e evolução dessa família de proteínas?

DRA. ANA GANDARA. As NADPH oxidases (NOX) ainda não são muito bem caracterizadas em artrópodes, porém uma proteína da família muito bem caracterizada é a DUOX, em Drosophila. Os estudos de DUOX em Drosophila são muito citados na literatura de mamíferos porque contribuíram muito para o entendimento da função dessa proteína. Na verdade, o estudo de DUOX independe do grupo estudo, mas a NOX mais estudada é a NOX 2, que não está presente nos artrópodes. Ela é a mais estudada por que historicamente foi a primeira a ser descrita e é ela também uma proteína que está presente nos neutrófilos (células do sistema imunológico). Ali ela produz EROS que possuem conhecidamente uma ação bactericida. Sabe-se que algumas mutações no gene da NOX 2 causam doenças seríssimas, como CGD (Chronic Granulomatous Disease), em que a pessoa não tem uma defesa apropriada no sistema imune justamente por causa da deficiência na NOX 2.

A DUOX é a mais estudada em insetos porque seu mecanismo de ação foi primeiramente elucidado em Drosophila. E como ela tem função semelhante a NOX 2, atuando na proteção contra microorganismos e patógenos. Muitos estudos de microbiota consideram que o controle dos microorganismos por DUOX é muito importante. Essa proteína está presente em células do intestino e produz peróxido de hidrogênio que mata esses microorganismos.

O que trazemos de novo no nosso trabalho é um update do trabalho publicado em 2007 por um grupo norte-americano, entretanto nós mostramos que a história é um pouco diferente daquela que eles descreveram. Na verdade, não existe uma NADPH exclusiva de dípteros hematófagos. O que existe é uma NADPH oxidase exclusiva de artrópodes! Nós demos uma organizada e uma atualizada nos dados que confirmou essa informação.

Em relação à função, não podemos saber ainda muitos detalhes. Nesse trabalho, a gente buscou — nos expressions maps de Anopheles gambiae e Aedes aegypti — a expressão desse gene nos microarray depositados. Dessa forma, vimos que, em determinado microarray, a NOX está cinco vezes mais expressa em uma condição biológica que outra. Com os dados obtidos, pudemos levantar a hipótese de que provavelmente a NOX estava também envolvida em desenvolvimento embrionário e estado alimentar, por exemplo. Isso indica que essa proteína é importante e parece excluir a hipótese de que este seja um pseudogene, porque ele possui expressões diferenciadas em algumas condições.

Parece que a evolução por perda gênica é um trabalho difícil de ser feito. Na anotação de genomas e transcriptomas existe sempre a dúvida se a informação sequenciada representa 100% dos genomas ou transcriptomas. Por isso, se perde informação real e fica difícil dizer que alguma coisa não esteja ali. Então as vezes buscamos informações em um genoma e quando vemos que algo não está presente isso não quer dizer que realmente não exista… isso porque pode ter acontecido por que os dados tenham sido mal anotados ou que a sequencia daquele pedaço em particular não tenha sido sequenciada. Há uma limitação em se estudar perda gênica porque parece que é muito difícil podermos ter 100% de garantia de aquilo realmente não exista. Estudar evolução por duplicação gênica é mais fácil, porque se ele duplicou é porque ele está lá. Nós citamos animais que vivem em lugares escuros e perdem genes de melanina e genes de visão porque não usam esses genes. Assim, a perda gênica tem uma função importante na evolução desses organismos.

Portanto, o que sabemos é que esse gene foi mantido fortemente em algumas linhagens, mas algumas linhagens temos evidência de que eles se perderam. Ainda não podemos explicar o porquê disso já que não conseguimos encontrar nenhum padrão de perda gênica. Até o momento parece que é uma perda aleatória.

PORTAL BIOQMED. E vocês observaram a perda da função de algum gene?

DRA. ANA GANDARA. Isso a gente não pode responder porque não foi feito experimento que indicasse. O que podemos sugerir através dos dados do expressions maps é que a NOX está mais expressa quando o organismo está alimentado, por exemplo. Com esse estudo, nós pudemos relembrar à comunidade científica que existe um gene que foi descrito há dez anos e que caiu um pouco no esquecimento. A gente observou que muitos organismos possuem esse gene e que ele é muito interessante e assim devemos voltar a estuda-lo. Esse gene codifica uma NOX funcional e isso a gente comprovou com experimentos em bancada e ninguém parece estar estudando ele ainda.

PORTA BIOQMED. No estudo, vocês sugeriram que o gene NOXm deve ser renomeado para NOX4-art. Quais novos dados os levaram a sugerir essa mudança no nome do gene? O que você pode sugerir com a deleção da NOX-4 art. em algumas linhagens?

DRA. ANA GANDARA. Como mencionamos, o nome do gene era dado como NOXm porque era relacionada a mosquito e não é mais. Assim, adicionamos no novo nome o sufixo art (de artrópodes) porque ele não é exclusivo de mosquitos. Inicialmente tínhamos chamado ele apenas de NOXart, mas concordamos em nomear para NOX-4 art por ser uma NOX muito relacionada a NOX 4 de mamíferos, contudo, não é uma NOX 4.

Nosso trabalho descreve bem as diferenças entre elas. Mostramos quais são as diferenças estruturais dos genes que podem fazer toda diferença na hora em que a proteína está efetivamente trabalhando. Ela não é uma NOX 4 porque existem diferenças na estrutura primária da sequência gênica. E nós usamos dados de literatura para confirmar essas informações. Utilizamos dados já publicados para responder qual aminoácido ou micro-domínio estaria envolvido na produção de peróxido de hidrogênio em NOX 4, por exemplo. Buscamos todos os aminoácidos que são chave e que estariam envolvidos no funcionamento daquela enzima e então procuramos nas nossas sequências.

Com isso, descobrimos que a diferença mais relevante encontrada foi que a NOX 4 de animais precisa estar associada à proteína p22 para funcionar. Sem essa p22 ela não produz peróxido de hidrogênio. E nenhum transcriptoma de artrópode tinha a p22. Depois de analisarmos os dados genômicos, chegamos à conclusão de que nenhum artrópode possui a p22. Talvez exista outra proteína associada a NOX-4 art mas ela não é conhecida e não é parecida com a p22 porque, se fosse parecida, teríamos encontrado na busca. Isso sem contar as diferenças na ordem dos aminoácidos. Mas ambas produzem peróxido de hidrogênio e isso foi predito por ferramentas de bioinformática.

Com a deleção da NOX-4 art em algumas linhagens, sugerimos que possa ter acontecido uma substituição dela pela DUOX, em algumas funções. Mas só podemos comprovar realizando experimentos específicos para responder a essa pergunta, mas isso ainda não foi feito. O que estou fazendo atualmente é determinar a função dela no mosquito adulto de Aedes.

PORTAL BIOQMED. Com seu trabalho, novos questionamentos foram levantados para estudos posteriores?

DRA. ANA GANDARA. Uma boa pergunta que você fez é o que poderíamos sugerir com a deleção da NOX-4 art. em algumas linhagens. Essa é uma boa questão. O que aconteceu nas linhagens que não a têm? Elas deixaram de fazer aquela função? Ou a função da NOX 4 teria sido substituída? O questionamento mais óbvio levantado é: o que elas fazem? Mesmo isso nós ainda não sabemos. Estamos procurando essa resposta agora em Aedes. Recentemente, um pesquisador estava trabalhando com esse gene em mariposa e ele fazia o trabalho de matar bactérias, participando assim do sistema imune através da produção de peróxido de hidrogênio.

PORTAL BIOQMED. Sabemos que sem ciência é impossível o avanço de qualquer país. Nós acompanhamos a Marcha pela Ciência, que foi abraçada pela ciência mundialmente. Como você vê a importância de um movimento como esse para tentar realizar uma melhor viabilidade e a valorização da ciência nacional?

DRA. ANA GANDARA. Particularmente, acredito que manifestações de ruas são válidas. Eu apoio muito a Marcha pela Ciência. O movimento na rua é sempre importante porque simboliza um incômodo real, porque para fazer as pessoas saírem de casa é porque está incomodando mesmo. E se existe uma manifestação grande e organizada, ela é importante e deve existir, mas ela não vai funcionar se ela não houver alguém do outro lado com um canal aberto.

Se os canais políticos se esgotaram, se os canais da conversa e comunicação se esgotaram, não resta outro caminho que não seja a manifestação na rua organizada, como é a Marcha pela Ciência. Então sim, eu considero importante a partir do momento que os caminhos principais se esgotaram, que é o de conversa e discussão de direcionamento de financiamento. Além de também chamar a atenção para um problema público que diz respeito ao país. Além disso, a gente pode ver que a Marcha pela Ciência não é abordada pela mídia nacional, acho que é uma movimentação muito pequena ainda e com isso me refiro à comunidade científica mesmo, porque acho que nem a comunidade universitária está envolvida ou sabe muito bem sobre a Marcha pela Ciência. Ela precisa ainda ser ampliada no âmbito universitário. Eu não sei se o aluno da graduação que está fazendo Farmácia ou Biologia e que está no início da graduação tem conhecimento do que se trata esse movimento.

Foi publicado pela Nature uma matéria sobre a Marcha pela Ciência questionando ”Você é a favor ou contra?”, e tinha um percentual alto de quem era contra. Eles perguntavam: ”Quem vai ver?”. Ou seja, em outras palavras é apenas a própria comunidade científica que está se vendo e isso não faz muita diferença. Seria basicamente contar um problema para o outro que já tem consciência daquilo porque ele também vivencia aquele problema dentro da pesquisa. Então a questão era quem estaria vendo aquele movimento. E se não tem cobertura de mídia comum, jornal ou televisão, ela vai continuar escondidinha. Não que eu considere que ela tenha que deixar de existir, mas se ela não for abraçada por alguma mídia real para essa discussão ser levada adiante fica difícil.

Temos a questão da FAPERJ, que acredito que só foi muito discutida porque a falência do estado estava sendo discutida e a FAPERJ estava junto. Com isso, muitas pessoas foram para a Alerj. Por isso, acho importante a manifestação de rua. O outro ponto é que muitos professores têm contatos com jornalistas e fontes publicitárias e assim podem chamar a atenção destes para produção de matérias e, consequentemente, atenção do público.

Posso concluir dizendo que se não existe um espaço no meio político ou na mídia, a discussão morre com a gente mesmo. O que deve acontecer é um movimento da comunidade científica em buscar atenção das pessoas de fora, para atingir os canais de mídia e também os políticos a fim de tornar essa questão pública. Porque se formos esperar, essa atenção não virá sem que seja feita algum esforço. Os canais buscam a comunidade científica quando tem epidemia de Zika, mas infelizmente eles não buscam a comunidade científica para discutir o financiamento e o desenvolvimento de ciência no nosso país…

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Créditos da imagem: Larissa Haerolde, Francisco Prosdócimi e Freepik

Recomendamos fortemente a leitura do artigo “Evolutionary origin and function of NOX4-art, an arthropod specific NADPH oxidase no site do periódico através do endereço eletrônico: https://bmcevolbiol.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12862-017-0940-0

* Gandara AC, Torres A, Bahia AC, Oliveira PL, Schama R. Evolutionary origin and function of NOX4-art, an arthropod specific NADPH oxidase. BMC Evol Biol. 2017 Mar 29;17(1):92. doi: 10.1186/s12862-017-0940-0. PubMed PMID: 28356077; PubMed Central PMCID: PMC5372347.

Por Larissa Haerolde e Francisco Prosdocimi para o portal BIOQMED.