Efeitos regulatórios de metabólitos do óxido nítrico na formação de fibras musculares

A formação de fibras musculares em nosso organismo envolve processos bioquímicos que são regulados pelas atividades e participação de diversas enzimas e moléculas, exigindo um equilíbrio na concentração e atividade das mesmas. O óxido nítrico é uma molécula chave relacionada a esses mecanismos, se destacando por contribuir para o controle das vias de sinalização envolvidas na formação e proliferação das fibras musculares, através de seus subprodutos produzidos. Para isso, o óxido nítrico interage com uma molécula citoplasmática chamada guanilato ciclase solúvel, ativando uma cadeia de eventos que irá culminar na formação das fibras musculares.

No entanto, em um novo estudo -- publicado em 1 de julho de 2017 por um grupo liderado pelo Prof. Leonardo Nogueira (IBqM) no periódico científico American Journal of Physiology Cell -- foi demonstrado que o óxido nítrico é capaz de se alternar em uma outra via, gerando os mesmos efeitos através de sua ligação ao grupo tiol de outras proteínas intracelulares, independentemente da guanilato ciclase.

Utilizando cultura de células embrionárias, o trabalho intitulado "Balance Between S-nitrosylation and denitrosylation modulates myoblast proliferation indenpendently of soluble guanylyl cyclase activation" mostrou como as nitrosilações e denitrosilações de proteínas intracelulares podem estar afetando a fusão dos mioblastos e interferindo diretamente na formação das fibras musculares.

O Prof. Leonardo Nogueira aceitou gentilmente responder algumas questões sobre seu artigo. Leia a seguir!

PORTAL BIOQMED. Bom dia, Prof. Leonardo! Sabemos que o óxido nitrico é uma molécula importante para múltiplas vias fisiológicas. Quais as principais vias em que o NO está envolvido e, em especial, quais são aquelas que envolvem o músculo esquelético? Como ele atua nesses casos?

PROFESSOR LEONARDO NOGUEIRA. O óxido nítrico é uma molécula que afeta muitos sistemas e que é produzida em todas as células do nosso corpo. Ele está envolvido em mecanismo de controle de função de neurônios e, obviamente, no mecanismo clássico que é a vasodilatação, dentre outros. No músculo esquelético, ainda não se tem muita ideia do papel do óxido nítrico na fisiologia no músculo. Mas, então, por que estudá-lo? Por que, de forma interessante, as células musculares esqueléticas possuem grandes quantidades das enzimas que produzem o óxido nítrico, as óxido nítrico sintases; e as principais óxido nítrico sintases que estão presentes nas fibras musculares esqueléticas têm sua atividade controlada por variação do cálcio intracelular. Como as células musculares apresentam, durante contração e relaxamento, grandes variações no cálcio intracelular, as células musculares esqueléticas possuem um potencial muito alto em produzir grandes quantidades de óxido nítrico durante a contração; essa quantidade é diminuída quando o músculo está relaxado. Então é possível regular a produção de óxido nítrico durante a contração e o relaxamento. Por causa dessa variação, os pesquisadores pensaram "será que o óxido nítrico tem algum efeito particular no músculo, já que possui tantos efeitos em tantas outras células?". Então, muitos pesquisadores decidiram estudar o papel do óxido nítrico que, como já foi demonstrado em outros tipos de células, poderia regular a proliferação e diferenciação das células musculares. Na década de 90, descobriu-se que a produção de óxido nítrico poderia estar envolvido no processo de regulação da formação de células musculares. Quando pensamos na fisiologia do músculo esquelético, não sabemos bem se existe algum papel do NO na contração e relaxamento do músculo adulto; mas já se sabe que ele tem um papel importante no processo de formação das células musculares.

Em nosso trabalho, estudamos um subproduto da produção da óxido nítrico. Então, o óxido nítrico no músculo esquelético parece estar envolvido de alguma forma (que é o que estamos tentando desvendar) na produção das células musculares através de um mecanismo muito pouco conhecido; ou através de um efeito também pouco conhecido sobre a fisiologia do músculo esquelético adulto. Mas nós focamos na formação das fibras musculares.

PORTAL BIOQMED. Como ocorre a formação do S-nitrosotiol e como essa molécula está envolvida nas vias de sinalização? Por que ela é importante?

PROFESSOR LEONARDO NOGUEIRA. Como disse anteriormente, o óxido nítrico tem algum papel sobre a formação das fibras musculares, mas o que as pessoas não entendiam muito bem era como o óxido nítrico influenciava no processo de formação dessas fibras. Um dos mecanismos propostos para a regulação desse processo seria através da interação do óxido nítrico com uma enzima, que é uma metaenzima, chamada guanilato ciclase solúvel. Quando o óxido nítrico é produzido e interage com essa enzima, uma molécula chamada de segundo mensageiro é produzida, o GMP cíclico; que é um sinalizador intracelular e que vai ativar algumas proteínas quinases que irão modular a formação das células musculares. Esse é um mecanismo que já é conhecido. Em nosso trabalho, reafirmamos e comprovamos que ele realmente existe, sendo que o óxido nítrico aparenta ter outros destinos, ou seja, o metabolismo do óxido nítrico tem múltiplos caminhos. Um dos destinos ou caminhos dele no meio intracelular é a formação da molécula de S-nitrosotiol. Quando o óxido nítrico, em meio aquoso, consegue interagir com cadeias laterais de aminoácidos, particularmente com cisteínas, o grupamento tiol da cadeia lateral da cisteína se liga ao óxido nítrico e forma um novo composto, justamente esse S-nitrosotiol.

Existem nitrosotióis de baixo peso molecular, que são os mais comuns. As nossas células possuem muitas moléculas de baixo peso molecular com tiol, principalmente glutationa (que age como antioxidante). Um outro nitrosotiol que pode também ser formado é aquele que permanece ligado às cisteína presente nas proteínas, que passam a ser chamadas de S-nitrosoproteínas. A formação de nitrosotióis em cisteínas pode afetar a função, principalmente enzimática, de muitas proteínas em muitas células. É conhecido que o excesso de nitrosilação em proteínas pode estar envolvido com inflamação ou neurodegeneração... Mas também pode estar envolvido com mecanismos fisiológicos relacionados às funções daquelas proteínas, regulando a diminuição ou aumento da atividade da enzima. A formação de nitrosotióis (que não é exclusiva de musculoso esquelético, ocorrendo em todas as células) pode afetar a produção de enzimas e, geralmente, é promovida pela formação de nitrosotióis de baixo peso molecular. Colocando em uma cadeia de eventos: o óxido nítrico é produzido pela óxido nítrico sintase (durante contração ou em situações em que há variações de cálcio intracelular, durante formação das células, por exemplo) e, uma vez produzido, pode formar nitrosotióis de baixo peso molecular, como a s-nitrosoglutationa. Essa s-nitrosoglutationa é conhecida por ser a principal molécula que transfere grupamento nitroso para proteínas. Se houver o aumento de s-nitrosoglutationa (GSNO) dentro da célula, normalmente as proteínas ficam nitrosiladas, mas se ele diminui, há então menos nitrosilação de proteínas. Uma vez formado, o GSNO pode nitrosilar proteínas ou pode ser denitrosilado. Há pouco tempo, descobriu-se que a concentração de GSNO pode ser regulada por enzimas que consomem GSNO, chamadas de denitrosilases, e a principal delas é a S-nitrosoglutationa redutase (uma enzima que reduz GSNO e produz dissulfeto de glutationa). Nossa pesquisa demonstrou que o conteúdo de nitrosotióis independente da formação do cGMP, que mencionei acima, e que é um importante regulador da formação de células musculares.

PORTAL BIOQMED. Então essa redutase estaria regulando os níveis de nitrosilação?

PROFESSOR LEONARDO. Sim, indiretamente. Diretamente ele parece controlar os níveis de GSNO e, indiretamente, parece controlar os níveis de S-nitrosilação de proteínas. Essa enzima é muito nova e, até onde sabemos, o principal controle dela ocorre a nível transcricional, ou seja, se há mais glutationa nitrosotiol redutase (GSNOR) ou menos; mas também depende dos níveis de substratos, que são o NADH e o GSNO. Como sempre há NADH em quantidades grandes na célula, o principal regulador é a quantidade de GSNO, portanto, se há muito GSNO, a enzima o consumirá. Essa enzima controla o conteúdo de GSNO intracelular, evitando que ele aumente muito.

PORTAL BIOQMED. De que forma os níveis intracelulares de S-nitrosotiol contribuem para formação e o desenvolvimento das fibras musculares?

PROFESSOR LEONARDO. O que mostramos no trabalho foi que o NO pode controlar a proliferação e a diferenciação das células musculares pelo mecanismo que já é conhecido, o convencional, que é produção de cGMP. Entretanto, o NO também pode controlar esses eventos através de um mecanismo independente que não havia sido estudado até então e que funciona através da formação de S-nitrosotióis. Não sabemos ainda onde ou a qual é nitrosilação das proteínas-chave. Demonstramos então que essa enzima evita que nitrosotióis controlem a formação de células musculares. A gente só identifica o papel da GSNO redutase quando inibe sua atividade, ou seja, o mecanismo está presente na célula e os nitrosotióis são capazes de modular a formação das fibras musculares.

Os nitrosotióis são ruins para formação das fibras musculares porque aumentam a proliferação mas diminuem a formação das fibras. E identificamos esse efeito quando inibimos a GSNO redutase. Sendo que fisiologicamente ela não está inibida, está presente. Então, na verdade, ela evita que esse mecanismo aconteça, ou seja, evita que o excesso de nitrosotióis iniba a formação de fibras musculares.

O equilíbrio entre formação e degradação de S-nitrosotióis intracelulares é importante para formação das fibras musculares esqueléticas, ou seja, se o conteúdo de S-nitrosotióis é alto demais, há muita S-nitrosilação de proteínas e isso aumenta a proliferação de células que ainda não são musculares (mioblastos). Por outro lado, isso inibe a formação das fibra a partir dos mioblastos, inibindo o processo de fusão dos mioblastos. Isso acontece quando as enzimas que consomem S-nitrosotióis estão inibidas; estas promovem denitrosilação, como é o caso por exemplo da S-nitrosoglutationa regutase - GSNOR. A denitrosilação é uma importante rota enzimática para controlar os níveis de S-nitrosotióis intracelulares, de forma que a proliferação e fusão dos mioblastos ocorra de maneira regulada durante a formação das fibras musculares.

Em células precursoras, o excesso de S-nitrosilação promove a proliferação, mas elas não formam fibras.

PORTAL BIOQMED. E em quais tipos de patologias esses mecanismos de S-nitrosilação podem estar envolvidos?

PROFESSOR LEONARDO. Não estudamos isso, mas se tivéssemos que imaginar uma situação, poderíamos citar as doenças inflamatórias. Nessas doenças, há uma super produção de óxido nítrico intracelular promovida por células inflamatórias. Esse NO pode promover muita nitrosilação de proteínas! É conhecido que, em doenças inflamatórias, principalmente em doenças crônicas, uma das consequências é a atrofia muscular. Então, esses mecanismos estão presentes em patologias como na doença pulmonar obstrutiva crônica e na diabetes. O paciente perde a força muscular e a massa muscular. Uma possibilidade é que essa perda de massa muscular se dê por menor reparo das células musculares, porque ocorre uma menor formação de células musculares. Nossos músculos são danificados o tempo todo e, assim, temos que reparar nossas células o tempo todo também. O que se sabe é que a inflamação inibe a formação de células musculares.

PORTAL BIOQMED. Pacientes com síndrome de Guillain Barré são também afetados por atrofia muscular, será que isso também teria relação com o NO e seu metabolismo?

PROFESSOR LEONARDO. A síndrome de Guillain Barré está sabidamente associada com neurônios periféricos. Os músculos se atrofiam porque há uma perda de neurônio motor; nesse caso é um problema neuronal. Uma possível solução seria uma maneira de evitar que os neurônios periféricos morressem e fossem degenerados pela síndrome (que é autoimune). A atrofia muscular nessa doença é uma consequência de um problema neuronal. Então não há associação com nitrosilação nas fibras, considerando o que se sabe no presente momento. Mas muitas doenças apresentam grande atrofia muscular, esse mecanismo pode também estar envolvido com distrofias musculares, e isso é algo que gostaríamos de estudar! Ou seja, esse mecanismo de nitrosilação e denitrosilação de proteínas durante a formação de células pode estar envolvido tanto no processo da formação das células como no processo do reparo muscular danificado que ocorre em pacientes com distrofia muscular.

PORTAL BIOQMED. A formação da s-nitrosoglutationa (GSNO) envolve a reação entre o óxido nitrico com a glutationa. Qual o papel da denitrosilação da  S-nitrosoglutationa? Como a guanilato de ciclase está envolvida nisso?

PROFESSOR LEONARDO. O que mostramos nesse trabalho é que a via de ativação da proliferação de mioblastos pode ocorrer por ativação de guanilato ciclase e S-nitrosotióis, mas essas vias agem de forma independente. Ou seja, o efeito que vimos no controle da formação das células musculares ocorre por duas vias que não parecem interagir entre si. Uma é pela produção de cGMP pela guanilato ciclase e a outra e pelo controle intracelular de nitrosotióis.

PORTAL BIOQMED. De que forma os dados obtidos no estudo podem vir a serem aplicados?

PROFESSOR LEONARDO. Uma possibilidade é descobrirmos maneiras pelas quais possamos modular especificamente a GSNOR em algum momento da formação das células, seja na fase fetal ou durante o envelhecimento. Na fase fetal, existem algumas situações em que a formação de músculos é um pouco prejudicada, o que pode ocasionar problemas de saúde futuros se houver baixa formação de células musculares. Se conseguíssemos, na fase gestacional, controlar a atividade da GSNOR do feto, poderíamos modular a formação de fibras. Outra situação que talvez seja mais próxima de acontecer é, durante o envelhecimento, quando acontece a sarcopenia, que é a perda de massa e força musculares que ocorre em grande velocidade durante essa fase, principalmente depois dos 65 anos. Por isso, as pessoas perdem muito da sua mobilidade e independência, não conseguindo caminhar ou realizar atividades simples.

Então, se pudéssemos modular a GSNOR afim de promover proliferação das células e depois inibir a GSNOR para que essas células proliferadas pudessem fusionar-se para produzir fibras musculares maduras, aí a gente conseguiria minimizar os efeitos da perda de massa muscular que acontece no envelhecimento.

PORTAL BIOQMED. Sabemos que o investimento em pesquisa no Brasil é baixo: tanto no desenvolvimento da ciência, como o salário dos profissionais, que também são baixos em relação aos padrões mundiais. Isso tem estimulado a fuga de cérebros no país. Diante desse cenário, a ideia de criação de um partido em prol da ciência vem circulando na comunidade científica. Atualmente, qual como está a representação da educação e ciência no governo? Qual sua opinião sobre organizações e a possibilidade de um partido político para a ciência?

PROFESSOR LEONARDO. Eu acharia muito interessante um partido político para ciência, porque ninguém fala na ciência. Falam de contingenciar, mas o contingenciamento não prevê algo que qualquer país sério no mundo prevê: que são as áreas estratégicas! Em 2008, por exemplo, os EUA vivenciaram uma crise imensa. É verdade que lá não houve um aumento do financiamento para pesquisa, mas também não houve um contingenciamento do financiamento. Isso aconteceu porque eles vêm o contingenciamento do financiamento de pesquisas como uma relação estratégica, ou seja, é estratégico manter o financiamento de pesquisa porque ela tem uma reversão a longo prazo; se houver interrupção, esta também retornará a longo prazo. Eles sofreram uma grande crise e contingenciaram o orçamento deles, mas se preocuparam com as áreas estratégicas, que são: ciência, tecnologia e educação. Infelizmente, aqui no Brasil, o contingenciamento não tem relação estratégica nenhuma. Mas isso se dá também, em parte, porque a nossa população científica não é representada pelos nossos legisladores. Escolhemos legisladores que tem obviamente ideologias políticas X ou Y, mas, por causa da ciência e tecnologia, raros são os que falam sobre, ou só falam para ganharem votos. Não há ninguém comprometido com ciência. Eles não precisam ser maioria no congresso, mas precisa existir alguém que tenha como base principal educação, ciência e tecnologia. Esse realmente é um problema sério! A gente não tem representatividade, na minha opinião.

É também verdade que alguns profissionais estão saindo do país, obviamente não em volume muito grande. Quando pensamos que o pesquisador está saindo do Brasil, vemos que existem dois caminhos: ele pode estar saindo por um tempo apenas, mas alguns ficam para sempre. Ainda assim, muitos pesquisadores daqui não querem ficar nos EUA por várias razões, sendo uma delas a forte competitividade. Quanto mais tempo o pesquisador fica no Brasil, menos tempo ele tem para se dedicar a pesquisa comparado aos outros países. Isso se deve muito ao fato de que o professor é alocado nas mais diferentes funções, existe muito desvio de função de professor. Por isso ele acaba se tornando menos competitivo para conseguir uma posição de professor fora do Brasil. Então não é simples sair do Brasil e se tornar um professor fora, porque vamos competir com pessoas que têm uma velocidade de produção científica maior que a nossa; e é isso é complicado.

Agora, eu vejo que de um lado isso pode ser um problema, mas também vejo que é um fluxo que pode ocorrer em qualquer outra profissão. Nos EUA, o pesquisador que também receber uma oferta melhor fora, também vai sair. Faz parte do mercado de trabalho. Por isso, não vejo com tanta preocupação o êxodo de profissionais. Mas o mais complicado é a falta de representatividade e achei essa possibilidade de representação política muito interessante...

Recomendamos fortemente a leitura do artigo ''Balance between S-nitrosylation and denitrosylation modulates myoblast proliferation independently of soluble guanylyl cyclase activation'' no site do peródico através do endereço eletrônico: http://ajpcell.physiology.org/content/313/1/C11.long

Formato para citação:

*Aline M. S. Yamashita, Maryana T. C. Ancillotti, Luciana P. Rangel, Marcio Fontenele, Cicero Figueiredo-Freitas, Ana C. Possidonio, Carolina P. Soares, Martha M. Sorenson, Claudia Mermelstein, Leonardo Nogueira. Balance between S-nitrosylation and denitrosylation modulates myoblast proliferation independently of soluble guanylyl cyclase activation. American Journal of Physiology - Cell Physiology Jul 2017, 313 (1) C11-C26; DOI: 10.1152/ajpcell.00140.2016

Por Larissa Haerolde e Francisco Prosdocimi para o portal BIOQMED.