TRP3: um peptídeo antimicrobiano com afinidade por membranas lipídicas carregadas negativamente

No dia 20 de dezembro de 2016, a revista científica Biophysical Journal publicou um estudo realizado por um grupo de pesquisadores liderados pela Profa. Ana Paula Valente (IBqM/UFRJ) que mostrou os efeitos que ocorrem na estrutura de um peptídeo antimicrobiano após sua ligação com diferentes tipos de membrana. O trabalho foi feito justamente com o objetivo de avaliar essa dinâmica de ligação entre o peptídeo e a membrana. A ideia foi demonstrar a possibilidade de produção de moléculas bioativas com efeito antibiótico.

A  TRP3 (tritrpticina) foi o peptídeo modelo de estudo no trabalho intitulado ‘‘Structural and Dynamic Insights of the Interaction between Tritrpticin and Micelles: An NMR Study''. TRP3 é um peptídeo catiônico da família das Catelicidinas que possui ampla atividade antimicrobiana. Ele é constituído de 13 resíduos de aminoácidos, estando presentes nessa sequência: VRRFPWWWPFLRR. A TRP3 contém portanto três resíduos triptofano consecutivos (o que conferiu a denominação TRP3), cuja importância está relacionada ao seu mecanismo de ação e interação com membranas já que o triptofano é um aminoácido de características apolares. Sua estrutura primária, embora simples, pode sofrer alterações conformacionais complexas, o que, segundo o artigo, é decorrente de sua interação com membranas. No entanto, quando ocorre uma ligação desse peptídeo à membrana, uma estrutura conformacional (geralmente anfipática) é estabelecida em TRP3. As atividades de TRP3 envolvem, além da capacidade de interação com a membrana, a capacidade de identificar seus alvos com alta especificidade, atuando contra bactérias Gram-positivas, Gram-negativas, células mamíferas e fungos.

Estudos recentemente publicados relataram ainda que TRP3 conseguiu inibir a síntese de DNA e proteínas em E.coli, além de induzir o movimento flip-flop dos lipídeos e se comportar como poro toroidal dinâmico na membrana, que pode mudar a permeabilidade dela. Embora os mecanismos de interação com a membrana sejam muito estudados, ainda não foram totalmente elucidados em nível molecular. A fim de compreender melhor e contribuir com novas informações sobre as interações de TRP3 com as interfaces hidrofóbicas de micelas na região hidrofílica, o trabalho determinou as diversas estruturas desse peptídeo antimicrobiano e utilizou a RMN (ressonância magnética nuclear), uma tecnologia analítica desses sistemas dinâmicos através do uso de campo magnético, além da sonda paramagnética. Essa dinâmica foi avaliada na presença de micelas de natureza química distinta, como a LLPC, a DPC, a DDMAB e outras.

De acordo com os resultados, o TRP3 revelou interagir com as membranas sob seletividade conformacional apresentando estrutura similar em todos os sistemas de micelas estudados após sua ligação. Sabe-se que essa diversidade estrutural é responsável pela ligação entre o peptídeo e as membranas lipídicas provenientes de diferentes natureza química. A ideia é que, no mecanismo de seleção conformacional, uma ligação principal (de domínio) entre o peptídeo e a membrana se estabeleça, o que confere um ajuste estrutural na molécula, induzindo e otimizando essa interação. Os resultados também evidenciaram que os três triptofanos presentes no esqueleto do peptídeo podem contribuir para sua localização na região da interface membrana-água e que pode existir uma preferência por micelas carregadas negativamente.

Convidamos a Profa. Ana Paula para responder algumas perguntas sobre seu trabalho.

PORTAL BIOQMED. Bom dia, Profa. Ana Paula! Gostaríamos de agradecê-la pela gentileza de esclarecer algumas questões sobre o seu trabalho. Vocês afirmam sobre a importância dos resíduos de triptofano na estrutura do peptídeo TRP3. De que forma esses resíduos são importantes para a interação com membranas e para o mecanismo de ação da TRP3?

PROFESSORA ANA PAULA VALENTE. Acredito que seja importante salientar duas características: (i) a primeira é que esse peptídeo possui três triptofanos seguidos. Sabemos que a cadeia lateral do triptofano é grande e, portanto, é como se essa cadeia possuísse três grupos bem volumosos naquela região. Isso já impõe ao peptídeo uma certa restrição conformacional por que ele tem um impedimento estérico, ou seja, não é qualquer posição que ele pode ocupar. Isso irá gerar um impacto na interação dele com a membrana. Outra coisa (ii) é que ele é um anel aromático (o triptofano) e esses anéis aromáticos têm uma interação especial com grupos da cadeia polar da membrana. Essa delocalização de elétrons faz com que haja um dipolo induzido e isso vai ser importante para interação com o fosfato e com a colina. A interação dos triptofanos com essa região já é um fenômeno bem descrito. Um trabalho publicado por um outro grupo analisou várias proteínas de membrana e eles perceberam que os triptofanos ficam margeando a parte polar da membrana, ou seja, eles preferem ficar perto da parte polar.

PORTAL BIOQMED. Já existe um trabalho publicado que descreva a substituição dos resíduos de triptofano por outros resíduos. Em que isso poderia influenciar? Algum outro fator poderia determinar mais especificamente essa variação na conformação?

PROFESSORA ANA PAULA. Geralmente os 3 triptofanos modulam a seletividade do peptídeo, por exemplo, um dos testes que eles fazem é a hemólise: nesse caso, ele altera a capacidade de hemólise de peptídeo, geralmente aumentando essa capacidade. Dependendo do resíduo que seja modificado, a atividade antimicrobiana pode ser perdida. Além dos triptofanos, existem também as prolinas do lado, o que trava ainda mais a conformação do TRP3!

Acreditamos que a presença desses resíduos aromáticos pertinhos uns dos outros impõem uma restrição, assim como as prolinas, e isso faz com que se tenha uma possibilidade de mudança conformacional menor. Quando a gente pega um peptídeo e faz uma dinâmica molecular ou um gráfico de Ramachandran, percebemos que o peptídeo sozinho não pode ocupar muitas posições no Ramachandran: isso significa que ele tem realmente uma limitação estrutural.

PORTAL BIOQMED. Você pode explicar pra gente o que é o poro toroidal?

PROFESSORA ANA PAULA. O TRP3 é capaz de formar o que chamamos de poro toroidal, mas não forma um canal estável. É como se esse poro fosse uma coisa mais dinâmica, ele abre e fecha. O que a gente acredita é que esse peptídeo interaja com a parte hidrofílica e hidrofóbica e altere a permeabilidade da membrana. Como exatamente isso acontece, a gente ainda não sabe... é difícil caracterizar esse poro experimentalmente. O que sabemos é que ele muda a permeabilidade e causa extravasamento de conteúdo citoplasmático, mas ao mesmo tempo sabemos que ele não forma uma estrutura estável. Quando ele se liga à membrana, não fica aberto o tempo todo, ele interage, abre, perde conteúdo, então provavelmente a membrana se reorganiza e mexe de novo. O que acontece é que a parte hidrofóbica do lipídeo vai querer ficar quietinha ali, porque não quer ver água, então terá essa força, essa tentativa dos lipídeos de interagirem e essa tentativa dos lipídeos de separar. Haverá um balanço de forças ali, um fenômeno local.

PORTAL BIOQMED. Foram observadas condições que poderiam influenciar ou interferir na ligação do peptídeo com a membrana? E ele teve preferência por algum tipo de micela? Vocês utilizaram vários tipos de modelos de micelas, certo?

PROFESSORA ANA PAULA. Não, o peptídeo é super ávido por interface. Estudos feitos no laboratório da Profa. Shirley (uma das coautoras deste trabalho), feitos com diversas vesículas, demonstram que o peptídeo interage com elas em todas as situações. Não encontramos nenhuma condição em que ele não interaja. De fato, encontramos o contrário, talvez ele goste mais da carga negativa. E sim, houve preferência pela micela do tipo LLPG. Vimos isso através dos dados usando sonda paramagnética. Num dos gráficos das últimas figuras, mostramos que os efeitos da sonda paramagnética é um pouquinho menor no LMPG. A gente acredita que isso acontece porque ele está mais inserido, mais escondido do solvente do que o LLPC.

PORTAL BIOQMED. A composição lipídica das membranas modelo têm suas propriedades funcionais ou estruturais modificadas durante a ligação ao peptídeo?

PROFESSORA ANA PAULA. A gente acredita que o peptídeo altera a permeabilidade da membrana... de alguma forma, o TRP3 consegue modular a interação entre os fosfolipídeos. Ele é capaz de separar os lipídeos momentaneamente e então extravasar conteúdo citoplasmático. A ideia de estudar diferentes composições de micelas é entender como ele age na bactéria e não age na célula eucariótica. Acreditamos então que no LMPG, essa característica mais negativa que tem nas bactérias, ajude nessa propriedade de seletividade do peptídeo. Mas ainda não compreendemos completamente como acontece essa seletividade.

PORTAL BIOQMED. Vocês pretendem continuar estudando esse peptídeo?

PROFESSORA ANA PAULA. Sim, uma das nossas ideias é clonar o peptídeo para que possamos obte-lo marcado, já que o RMN é uma técnica em que a gente pode analisar outros núcleos atômicos. Então, se tivermos recombinantes, poderemos marcar os carbonos ou os nitrogênios e assim abrir uma maior possibilidade de estudos. Podemos fazer por estado sólido, etc. Outra coisa que consideramos interessante é estudar outros peptídeos dessa família. Temos algumas ideias. Até agora usamos o próton e marcamos um resíduo só, a leucina, mas quando tivermos o peptídeo clonado poderemos marcar ele inteiro e assim acompanhar melhor o que está acontecendo.

PORTAL BIOQMED. E como essas novas informações podem ser aplicadas?

PROFESSORA ANA PAULA. O que as pessoas fazem é usar essas informações para buscar novas drogas. Podemos buscar esse agrupamento de grupos volumosos, buscar fixar mais a estrutura, já que com uma estrutura mais fixa, temos uma maior afinidade da droga. Portanto, podemos usar cada uma dessas características para desenhar e selecionar novos compostos.

Alguns peptídeos desse tipo já foram selecionados e já se tem aplicação prática. Um deles, a magainina, já chegou a ser introduzido no mercado como uma droga. A grande dificuldade que vejo é sintetizá-los, já que a síntese desses compostos ainda é de certa forma cara e a indústria farmacêutica ainda não investiu completamente nesse sistema. Existem alguns casos, mas ainda não é o composto de escolha.

PORTAL BIOQMED. Como você avalia a qualidade das pesquisas que vem sendo produzidas em massa a nível mundial, visto que muitas delas não chegam a serem aplicadas clinicamente?

PROFESSORA ANA PAULA. Eu vejo o sistema como uma pirâmide e, assim, não me espanta que a gente tenha muitas publicações que vão mapear o sistema. Até um cientista chegar ao ponto de uma ter aplicação clara dos seus estudos, ele tem de analisar aquele problema por diferentes visões. Imagine que esteja olhando um objeto. Eu não irei olhar somente num ponto, mas em vários ângulos. A somatória desses estudos é que vai levar a um produto final, essa é a ideia da pirâmide. É sempre muito difícil quando se está estudando o básico saber o que vai virar um produto importante. Por exemplo, teve um quimioterápico amplamente utilizado na clínica que foi descoberto da asa de uma borboleta, e eu duvido que o pesquisador imaginou que iria descobrir esse composto. Antes de obtermos o produto, precisamos conhecer o sistema também. Claro, o intuito é melhorar a vida dos seres vivos, mas acho que essa ideia de conhecer move diferentes visões.

 Créditos da imagem: Larissa Haerolde, Francisco Prosdócimi e Freepik

Recomendamos fortemente a leitura do artigo ''Structural and Dynamic Insights of the Interaction between Tritrpticin and Micelles: An NMR Study'' no site do periódico através do endereço eletrônico: http://www.cell.com/biophysj/abstract/S0006-3495(16)30993-6

Formato para citação:

* Santos TL, Moraes A, Nakaie CR, Almeida FC, Schreier S, Valente AP. Structural and Dynamic Insights of the Interaction between Tritrpticin and Micelles: An NMR  Study. Biophys J. 2016 Dec 20;111(12):2676-2688. doi: 10.1016/j.bpj.2016.10.034. PubMed PMID: 28002744; PubMed Central PMCID: PMC5194225.

Por Larissa Haerolde e Francisco Prosdocimi para o portal BIOQMED.